Inleiding

In een gezonde mond bestaat een ecologisch evenwicht tussen micro-organismen en gastheer. Wanneer dat evenwicht wordt verstoord, bijvoorbeeld door ondermaatse mondzorg, kunnen pathogene micro-organismen de overhand krijgen. Dit kan vervolgens resulteren in verschillende aandoeningen waaronder cariës, gingivitis, parodontitis en halitose. Voor het verkrijgen van inzicht in het ontstaan van de aandoening of de evaluatie van een behandeling, kan het identificeren en kwantificeren van micro-organismen of ontstekingsmediatoren een belangrijke bijdrage aan tandheelkundige zorg leveren. Idealiter zouden deze testen direct aan de stoel gebruikt kunnen worden, bij voorkeur nog voordat er klinische verschijnselen optreden. Veel huidige methoden van microbiologische en biochemische (vroeg)diagnostiek zijn hiervoor echter niet geschikt. Voor zowel de uitvoering van de analyse als voor de interpretatie van de uitslag zijn namelijk specifieke apparatuur en expertise nodig. Verder kan het dagen tot zelfs weken duren voordat een uitslag bekend is. In dit perspectief kan, in specifieke gevallen, een snelle, goedkope en simpel uitvoerbare diagnostische test de doelmatigheid van de verleende mondzorg verbeteren.

Speekselbiomarkers voor parodontitis

Doordat speeksel veilig en eenvoudig is te verzamelen, is het een aantrekkelijke vloeistof die kan helpen bij vroegdiagnostiek. Bij parodontale ontstekingen bijvoorbeeld sijpelen er verschillende stoffen van zowel de gastheer als van bacteriologische oorsprong van het ontstoken parodontale weefsel naar de gingivale creviculaire vloeistof (GCV) en speeksel (afb. 1). Deze stoffen, zoals ontstekingsmediatoren, enzymen en peptiden kunnen daardoor dienen als moleculaire verklikkers ofwel biomarkers, van het ontstekingsproces. Ook kunnen in geval van bloedingen stoffen zoals albumine en hemoglobine in de mond terecht komen. Deze eiwitten horen in een gezonde mond niet thuis en dienen daardoor ook als biomarker voor parodontitis (Giannobile, 2012; Ebersole et al, 2013).

De afgelopen jaren heeft het onderzoek naar parodontale biomarkers een vlucht genomen. Met behulp van gevoelige en geavanceerde technologieën, zoals massaspectrometrische technieken en biochemische testen, zijn er verschillende onderzoeken gedaan met als doel het totale parodontale inflammasoom (een verzamelnaam voor alle betrokken biomarkers in geval van een parodontale ontsteking) te ontrafelen. Afhankelijk van de gebruikte laboratoriummethodologie en analyses varieert het aantal en de soort van de parodontale biomarkers sterk: van een paar dozijn tot enkele honderden (Baliban et al, 2012; Prodan et al, 2015; Lira-Junior et al, 2017; Bostanci en Belibasakis, 2018).

Hoewel met deze uitgebreide analyses in GCV en speeksel de verschillende immunologische processen van parodontale ontstekingen goed in kaart zijn te brengen, zijn de kosten, complexiteit van deze analyses en de lastige interpretatie van de onderzoeksresultaten een belemmering voor de praktische implementatie voor diagnostiek in de tandheelkundige praktijk. Eén een bepaalde klasse enzymen, de proteasen, vormt hierop echter een uitzondering en kan de sprong naar een aanvullende test voor parodontale screening in de praktijk wél maken.

Proteasen

Proteasen breken eiwitten af door het splitsen van de verbinding tussen 2 aminozuren in een eiwitketen. In algemene zin spelen proteasen een rol in tal van biologische processen waaronder groei, ontwikkeling en afweer. Binnen de mondgezondheid spelen tientallen proteasen, van zowel bacteriële als humane herkomst, een belangrijke rol in een aantal aandoeningen. Voorbeelden hiervan zijn halitose, gingivitis en parodontitis.

Het parodontale proteasoom (het totale pakket proteasen die een rol spelen bij parodontitis) is zeer complex en betrokken bij een groot aantal moleculaire processen (Ebersole et al, 2013; Bostanci et al, 2018). Voorbeelden van bacteriële proteasen die een rol spelen bij parodontitis zijn karilysinen, dentilisinen en gingipainen. Deze proteasen zijn respectievelijk afkomstig van de zogenoemde ‘rode-complex’-bacteriën Tannerella forsythia, Treponema denticola en Porphyromonas gingivalis. De aanwezigheid en activiteit van deze proteasen leidt onder andere tot de afbraak van orale weefsels zoals collageen, wat kan leiden tot verlies van paradontale ligament en uiteindelijk van gebitselementen. Ook dragen proteasen bij aan de vorming van plaque en de ontmanteling van de natuurlijke afweer (Potempa en Pike, 2009). Als reactie hierop lanceert de gastheer op zijn beurt een verscheidenheid aan afweermechanismen. Een van deze afweermechanismen betreft de aanmaak van gastheerproteasen, de zogenoemde matrix metalloproteasen (MMPs) die een bijdrage leveren aan afweer en herstel (Sorsa et al, 2004).

Eerste bacteriële speeksel-protease test

Zoals hierboven reeds aangegeven hebben proteasen interessante eigenschappen voor het ontwikkelen van snelle aanvullende diagnostische methoden en testen. Ze verbreken namelijk in korte tijd (seconden tot minuten) de verbinding tussen 2 aminozuren in een eiwit of peptide, het substraat van de protease. Het verloop van de enzymatische splitsing kan met behulp van verschillende biochemische technieken, bijvoorbeeld door kleurverandering of het ontstaan van fluorescentie worden aangetoond (afb. 2).

In 1990 werd een eerste, voor in de praktijk bruikbare methode ontwikkeld waarmee door middel van een kleuromslag de aanwezigheid van bepaalde bacteriële proteasen in speeksel kon worden aangetoond. Deze methode staat bekend als de BANA-test (OraTec Corporation) en maakt gebruik van het proteasesubstraat benzoyl-DL-arginine-naphthylamide (BANA) (Loesche et al, 1990). De BANA-test was initieel ontwikkeld voor het aantonen van proteasen afkomstig van de ‘rode-complex’ bacteriën. Echter, de BANA-test bleek ook gevoelig voor afbraak door humane proteasen. Bovendien bleek het kleursignaal van dit proteasesubstraat vaak laag, wat leidde tot een lage sensitiviteit en specificiteit. Mede hierdoor heeft de BANA-test binnen de tandheelkunde geen hoge vlucht genomen.

Gespiegelde aminozuren voor hogere bacteriële specificiteit

Ondanks de enorme complexiteit van het totale parodontale proteasoom, spelen in veel gevallen de proteasen van P. gingivalis, de gingipainen, een duidelijk herkenbare rol. Onderzoeken hebben namelijk aangetoond dat het gehalte aan gingipainen kan oplopen tot 85% van het totale parodontale proteasoom (Guentsch et al, 2013). Om deze reden zijn een aantal jaar geleden synthetische P. gingivalis-specifieke proteasesubstraten ontwikkeld. Kenmerkend voor deze substraten is de aanwezigheid van ‘gespiegelde’ aminozuren (afb. 3) die specifiek door bacteriële proteasen worden herkend (Galassi et al, 2012; Kaman et al, 2012). Door de aanwezigheid van deze gespiegelde aminozuren kon de substraat-specificiteit voor P. gingivalis worden verhoogd tot bijna 100%. Ter vergelijking: de specificiteit van de BANA-test was in hetzelfde onderzoek 85%. Daarnaast bleek de sensitiviteit van de nieuwe P. gingivalis-substraten 60-75% terwijl de sensitiviteit van de BANA-test op 40% uitkwam. Kortom, door gebruik te maken van gespiegelde aminozuren is een duidelijke verbeterslag gemaakt ten aanzien van specificiteit en sensitiviteit van proteasesubstraten voor diagnostiek. Op dit moment wordt er gewerkt aan een prototype handzame test op basis substraten met gespiegelde aminozuren (Alhogail et al, 2018). Een commerciële test, op basis van gespiegelde aminozuren, is op dit moment nog niet verkrijgbaar.

Analyse van humaan MMP-8

Een recentelijk geïntroduceerde, handzame test, die wel verkrijgbaar is en is gebaseerd op de detectie van de actieve vorm van het humane protease MMP-8 (aMMP-8), betreft de Periosafe-test (PerioSafe™). In tegenstelling tot de BANA-test en de methode met de gespiegelde proteasesubstraten meet de Periosafe geen protease-activiteit, maar het gehalte aMMP-8 in GCV en speeksel. Het gebruik ervan is eenvoudig: GCV, speeksel of mondspoelsel wordt bij een patiënt afgenomen en op een teststrookje aangebracht. Na 5 minuten wordt zichtbaar of het gehalte aMMP-8 boven een bepaalde drempelwaarde ligt; ter illustratie vergelijkbaar met het uitlezen van een zwangerschapstest. Dit maakt deze test in principe geschikt voor screeningdoeleinden of ondersteunend diagnostisch onderzoek. Echter, ondanks het gebruiksgemak en de snelheid is de uitslag van de Periosafe-test indicatief; uit onderzoek blijkt dat de gevonden specificiteit en sensitiviteit variëren afhankelijk van de gekozen klinische set-up. Volgens de ontwikkelaars bereikt de Periosafe een specificiteit van 97% en een sensitiviteit van 83%; in de praktijk leiden deze waarden alsnog tot een vals-positief gestelde diagnose van ongeveer 40 % (Mäntylä et al, 2003, Heikkinen et al, 2016, Gosselink, 2016). Verder moet worden opgemerkt dat aMMP-8 niet specifiek is voor parodontale ontstekingen, aangezien MMP-8 ook betrokken is bij diverse andere fysiologische en infectiegerelateerde processen binnen en buiten de mondholte (Dejonckheere et al, 2011). MMP-8-gehaltes blijken bijvoorbeeld ook verhoogd in geval van cariës, gingivitis en peri-implantitis, wat een passende uitspraak op basis van deze test alléén lastig maakt (Hedenbjork-Lager et al, 2015; Thierbach et al, 2016; Nascimento et al, 2019).

Tot slot

Recente klinische onderzoeken tonen aan dat het meten van de totale proteolytische activiteit in speeksel mogelijk een betere voorspellende kwalitatieve waarde heeft dan het meten van alleen bacteriële of humane proteasen (Bikker et al, 2019; Verhulst et al, 2019). Namelijk, de oorsprong, samenstelling en interactie tussen de proteasen onderling, in combinatie met de aanwezigheid van remmers en stimulatoren, dragen bij aan het ontstaan van de totale proteolytische activiteit. In dit licht is dus het meten van de totale protease-activiteit een logisch uitgangspunt. Deze test is eenvoudig en snel uit te voeren bij een patiënt. Omdat ook andere processen in de mond van invloed zijn op de uitslag van de test moet de uitslag van deze test, en alle bovengenoemde proteasetesten, worden gezien als aanvullend onderdeel van een uitgebreider diagnostisch onderzoek.

Literatuur

• Alhogail S, Suaifan GARY, Bizzarro S, et al. On site visual detection of Porphyromonas gingivalis related periodontitis by using a magneticnanobeadbased assay for gingipains protease biomarkers. Microchim Acta 2018; 185:149.
• Baliban RC, Sakellari D, Li Z, DiMaggio PA, Garcia BA, Floudas CA. Novel protein identification methods for biomarker discovery via a proteomic analysis of periodontally healthy and diseased gingival crevicular fluid samples. J Clin Periodontol 2012; 39: 203-212.
• Bikker FJ, Nascimento GG, Nazmi K, et al. Salivary total protease activity as predictor of induction and resolution of gingival inflammation. Mol diagn ther 2019; submitted.
• Bostanci N, Belibasakis GN. Gingival crevicular fluid and its immune mediators in the proteomic era. Periodontol 2000 2018; 76: 68-84.
• Bostanci N, Selevsek N, Wolski W, et al. Targeted proteomics guided by label-free quantitative proteome analysis in saliva reveal transition signatures from health to periodontal disease. Mol Cell Proteomics 2018; 17: 1392-1409.
• Dejonckheere E, Vandenbroucke RE, Libert C. Matrix metalloproteinase8 has a central role in inflammatory disorders and cancer progression. Cytokine Growth Factor Rev 2011; 22: 73-81.
• Ebersole JL, Schuster JL, Stevens J, et al. Patterns of salivary analytes provide diagnostic capacity for distinguishing chronic adult periodontitis from health. J Clin Immunol 2013; 33: 271-279.
• Galassi F, Kaman WE, Anssari Moin D, et al. Comparing culture, realtime PCR and fluorescence resonance energy transfer technology for detection of Porphyromonas gingivalis in patients with or without peri-implant infections. J Periodontal Res 2012; 47: 616-625.
• Giannobile WV. Salivary diagnostics for periodontal diseases. J Am Dent Assoc 2012; 143: 6S-11S.
• Guentsch A, Hirsch C, Pfister W,et al. Cleavage of IgG1 in gingival crevicular fluid is associated with the presence of Porphyromonas gingivalis. J Periodontal Res 2013; 48: 458-465.
• Gosselink K. Periosafe meet parodontale afbraak. Paropreventie met een strookje. Nederlands Tandartsenblad 2016; 71: 20-23.
• Hedenbjork-Lager A, Bjorndal L, Gustafsson A, et al. Caries correlates strongly to salivary levels of matrix metalloproteinase-8. Caries Res 2015; 49: 1-8.
• Heikkinen AM, Nwhator SO, Rathnayake N, et al. Pilot study on oral health status as sssessed by an active matrix metalloproteinase-8 chairside mouthrinse test in adolescents. J Periodontol 2016; 87: 36-40.
• Kaman WE, Galassi F, de Soet JJ, et al. Highly specific protease-based approach for detection of Porphyromonas gingivalis in diagnosis of periodontitis. J Clin Microbiol 2012; 50: 104-112.
• Lira-Junior R, Ozturk VO, Emingil G, Bostanci N, Bostrom EA. Salivary and serum markers related to innate immunity in generalized aggressive periodontitis. J Periodontol 2017; 88: 1339-1347.
• Loesche WJ, Bretz WA, Kerschensteiner D, et al. Development of a diagnostic test for anaerobic periodontal infections based on plaque hydrolysis of benzoyl-DL-arginine-naphthylamide. J Clin Microbiol 1990; 28: 1551-1559.
• Mäntylä P, Stenman M, Kinane DF, et al. Gingival crevicular fluid collagenase-2 (MMP-8) test stick for chair-side monitoring of periodontitis. J Periodontal Res 2003; 38: 436-439.
• Nascimento GG, Baelum V, Sorsa T, Tervahartiala T, Skottrup PD, Lopez R. Salivary levels of MPO, MMP-8 and TIMP-1 are associated with gingival inflammation response patterns during experimental gingivitis. Cytokine. 2019; 115: 135-141.
• Potempa J, Pike RN. Corruption of innate immunity by bacterial proteases. J Innate Immun 2009; 1: 70-87.
• Prodan A, Brand HS, Ligtenberg AJ, et al. Interindividual variation, correlations, and sex-related differences in the salivary biochemistry of young healthy adults. Eur J Oral Sci 2015; 123: 149-157.
• Sorsa T, Tjaderhane L, Salo T. Matrix metalloproteinases (MMPs) in oral diseases. Oral Dis 2004; 10: 311-318.
• Thierbach R, Maier K, Sorsa T, Mantyla P. Peri-Implant sulcus fluid (PISF) matrix metalloproteinase (MMP) -8 levels in peri-implantitis. J Clin Diagn Res 2016; 10: ZC34-38.
• Verhulst M, Teeuw WJ, Bizzarro S, et al. A rapid, non-invasive tool for periodontitis screening in a medical care setting. BMC Oral Health 2019; 19; 87.