Vervaardiging van proefstukjes voor simulatie van secuncaire cariës

Het ontstaan van secundaire cariës naast 3 verschillende restauratiematerialen werd in vitro onderzocht (zie infographic). De verschillende materialen waren:

• Composiet met conventionele bonding (CCB): Clearfil AP-X™ composiet + SE Bond™ (Kuraray Medical Inc) (n = 20).
• Composiet met antibacteriële bonding (CAB): Clearfil AP-X™ composiet + ProtectBond™ (Kuraray Medical Inc) (n = 20)
• Amalgaam (A): Dispersalloy™ amalgaam (Dentsply International) (n = 20).

De conventionele bonding werd gebruikt als negatieve controle. Amalgaam werd gebruikt als positieve controle.

Van elk restauratiemateriaal werden 20 blokjes van 3,2 x 3,2 x 2,0 mm vervaardigd volgens een eerder gepubliceerde methode (Kuper et al, 2015).Voor het maken van de blokjes werd in putty-mallen (3,2 x 3,2 x 2,0 mm) eerst primer aangebracht en vervolgens bonding, zodat de primer zich aan de kant van de randspleet zou bevinden. Na polymeriseren van de bonding (10 seconden, FusionTM S7 Curing Light™) werd het restauratiemateriaal in de putty mal aangebracht. De 2 composieten werden aangebracht en 20 seconden uitgehard (FusionTM S7 Curing Light™). Het amalgaam werd 17 seconden gemengd en vervolgens in de mal aangebracht. Overhang van het amalgaam werd een dag na uitharding bijgewerkt met behulp van 800 grit schuurpapier. Glazuur-dentineblokjes van hetzelfde formaat (3,2 x 3,2 x 2,0 mm) werden geprepareerd en gepolijst (n = 60).

De helft van de proefstukjes uit elke restauratiegroep (3 maal n = 10) en 30 glazuur-dentineblokjes werden ‘vers’ (maximaal 2 weken bewaard in water) gebruikt en de andere helft van de restauratiegroepen (3 maal n = 10) en de andere helft glazuur-dentineblokjes werden aan het volgende verouderingsprotocol onderworpen:

• 4 weken bewaren in water bij kamertemperatuur (wekelijks ververst), gevolgd door:
• 4 weken thermocycling (31.063 cycli, 10 seconden in gedestilleerd water van 55° C - 20 seconden uitlekken - 10 seconden in gedestilleerd water van 5° C – 20 seconden uitlekken), gevolgd door:
• 4 weken bewaren in menselijk speeksel (het speeksel werd ’s morgens verkregen van een gezonde vrijwilliger vóór eten of tandenpoetsen en werd elke 2 dagen ververst), gevolgd door:
• 8 weken bewaren in 0,9% zoutoplossing (elke 2 dagen ververst), gevolgd door:
• 8 weken bewaren in water bij kamertemperatuur (wekelijks ververst)

Na veroudering werden de blokjes tand- en restauratiemateriaal samen op balkjes van polystyreen bevestigd met een flowable composiet. Tussen het restauratiemateriaal en het tandmateriaal werd een matrix van 100 µm dik geplaatst om intentioneel een randspleet te creëren. De precieze grootte van de randspleten werd gemeten, ter plaatse van het oppervlak, met behulp van een WF10X lens (Future-Tech) van een microhardheidsmeter (Microhardness Tester FM-700) in combinatie met een M10/0.25 210/0 (Future-Tech).

Afb. Infographic van vervaardiging van de proefstukjes voor de simulatie van secundaire cariës.

De proefstukjes werden gesteriliseerd met behulp van gammastraling (totale dosis 4,08 kGy) in het Regionale Centrum voor Oncologie/Radiotherapie Service, Faculteit voor Geneeskunde in Pelotas (Brazil).

De gesteriliseerde proefstukjes werden aseptisch overgebracht in een steriele plaat (24-wells weefselcultuur plaat) en er werd 0,4 ml gehomogeniseerd speeksel op gedruppeld zodat de randspleet geheel bedekt werd. Na 1 uur incubatie bij 37⁰ C werd 1,8 ml mucine medium (defined mucin medium, DMM) met 1% sucrose toegevoegd. Na 6 uur werd het groeimedium vervangen door DMM zonder sucrose. Het verversen van DMM gebeurde gedurende het gehele experiment, waarbij medium met sucrose (6 uur) werd afgewisseld met medium zonder sucrose (18 uur). De biofilms werden geïncubeerd met verhoogd CO₂ door middel van het Anaerobac® systeem in een anaerobe omgeving bij 37⁰ C gedurende 20 dagen. Aan het einde van het experiment werden de proefstukjes schoongespoeld met 0,9% NaCl oplossing en werd de zichtbare biofilm weggeveegd met een gaasje gedoopt in gedestilleerd water. 

Voorafgaand aan het experiment (T0) en na 20 dagen (T20) werden T-WIM afbeeldingen gemaakt volgens de microradiografiemethode van Thomas et al (2006), ofwel de T-WIM-techniek. De resultaten van voorafgaand aan het experiment (T = 0) werden afgetrokken van de resultaten na 20 dagen (T = 20), om de ware laesiediepte te kunnen inschatten. Deze gecorrigeerde waarden werden gebruikt in de statistische analyse.

De proefstukjes van restauratie- en tandmateriaal werden als blokjes samengesteld vanwege de gebruikte analysemethode (T-WIM). Bij deze radiografische techniek hoeven proefstukjes niet te worden gereduceerd tot zeer dunne coupes om ze te kunnen analyseren, maar het is wel noodzakelijk dat de proefstukjes parallel worden geplaatst aan de centrale richting van de röntgenstralen, omdat anders een schaduw ontstaat die voor laesie kan worden aangezien (Thomas et al, 2006; Kuper et al, 2015). Om die reden waren de blokjes restauratiemateriaal en tandmateriaal op een polystyrene balk geplaatst met een randspleet van ongeveer 100 µm parallel aan de richting van de röntgenstraling.